肽-药物偶联物（Peptide-drug conjugate , PDC)是一类重要的治疗药物，它通过可生物降解的Linker将一个或多个药物分子与短肽结合。

图1 Pepaxto的作用机制（来源于pepaxto.com）

PDC和ADC（抗体-药物偶联物，antibody drug conjugate）有着相似的概念，但是它们的结构和性质却有很大的不同。ADC目前已在临床上用于癌症治疗，但由于单抗的大分子量使得ADC还存在一定的局限性。而PDC通常由线性或环状多肽组成[1]，结构灵活，分子量低（通常只有几个kDa），可以增加肿瘤的穿透性和选择性，提高疗效，减少癌症治疗的副作用。PDC作为一种新兴的靶向治疗方法正逐渐获得认可。

本文综述了PDC结构和分类、已获批上市的药物，并对PDC的药代动力学特点、生物分析方法进行简述。

一、PDC药物的结构

PDC和ADC的目标一样，都是为了提高化疗药物的疗效，并改善化疗药物循环半衰期短和脱靶副作用的缺陷。偶联物的三个主要成分是靶向配体、Payload和可生物降解的Linker。用于PDC的靶向配体的一般称为肿瘤归巢肽（homing peptide），能与靶细胞上的受体特异性结合。结合的药物一般为高毒性，如美登素、喜树碱衍生物、奥司他汀或阿霉素。Linker在药物偶联物的循环时间和药物在靶点的充分释放中起着关键作用。理想情况下，肽和Linker之间的键应不影响肽对其受体的亲和性，并有足够的循环时间到达靶细胞，且只有在癌细胞摄取偶联物进行选择性杀伤后才会释放未修饰的药物[2]。

图2 受体靶向药物偶联物的结构示意图[3]

二、PDC药物的分类

2.1 Linker

常见用于PDC的Linker的官能团有酶可裂解（酯、酰胺和氨基甲酸酯）、酸可裂解（腙和碳酸酯）、可还原二硫键和不可裂解（硫醚、肟和三唑）等。其中酶可裂解的酯键或酰胺键因可以在肿瘤微环境或溶酶体中进行选择性裂解，应用较为广泛。

2.2 Payload

许多小分子药物具有较强的药理活性，但也存在溶解性差、选择性差、半衰期短等缺点，易产生副作用和多重耐药，使其应用受到了限制[4]。而与多肽的结合可以克服这些缺点。许多Payload可以与多肽结合生成PDC，其中最常用的是细胞毒性药物。

细胞毒性药物

用于PDC的细胞毒性药物通常是经典的化疗药物，如紫杉醇、阿霉素（Dox）、喜树碱（CPT）等。通过干扰或阻断细胞增殖过程而归类为抗肿瘤药物，但肿瘤特异性靶向能力较差，在肿瘤细胞中的积累效率低，导致肿瘤细胞和正常细胞都受到损伤。在治疗过程中，肿瘤异质性、药物失活、转运代谢、药物靶点改变、肿瘤微环境功能障碍等均可引起耐药问题。PDC可增加肿瘤组织中细胞毒性药物，减少药物在正常组织中的分布，从而减少抗癌药物对正常组织的毒副作用，抑制多重耐药。

放射性核素

放射性核素也是常用于PDC的化疗药物。当PDC用于癌症诊断时，可以用发射正电子的放射性同位素（氟-18(18F)、铜-64(64Cu)和镓-68(68Ga)）标记来生成PET成像（PET imaging），或γ射线放射性同位素锝-99m (99mTc)和碘-123(123I)可用于单光子发射计算机断层扫描（single-photon emission computed tomography，SPECT）[3]。通过与肿瘤细胞上的靶向受体结合，精确定位恶性组织。放射性核素标记的PDC也可以用于治疗。肽受体放射性核素治疗（PRRT）允许基于肿瘤细胞的过表达受体对肿瘤细胞进行定向和组织特异性辐射。不同的放射性金属是天然的或合成的，每一种都具有不同的特性。最常用的放射性核素有铟-111(111In), 钇-90(90Y)和镥-177(177Lu)。

其它Payload

用于设计PDC的还有siRNA和反义寡核苷酸。

3.3 肽

用于PDC的肽一般可分为两类：细胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）和细胞靶向肽（cell targeting peptides，CTPs）。

细胞穿透肽

细胞穿透肽是能够穿过细胞膜的短肽(至多30个残基)，两个特征是正电荷和两亲性。CPPs能够跨细胞膜运输药物，但跨细胞膜的摄取机制尚未完全了解[5]。

CPPs可分为蛋白衍生CPPs、修饰CPPs和设计CPPs三类。蛋白质衍生CPPs通常由亲本易位蛋白的最小有效序列组成，也称为蛋白质转导域或膜易位序列。修饰CPPs含有与不同来源的CPPs结构相似的序列。设计CPPs通常是由亲水性和疏水性结构域组成的嵌合多肽，形成两亲螺旋结构。

CPP介导的渗透是非选择性和非受体依赖性的，这导致CPP-药物偶联物缺乏肿瘤特异性，使CPP的广泛应用受到了限制。

细胞靶向肽

细胞靶向肽与单抗具有相同的能力，与肿瘤细胞表面过表达的受体有高亲和力[3]。当治疗药物与CTPs偶联时，它们可以被运输并富集在靶点，这大大减少了药物的副作用。

图3 肿瘤细胞上的受体与PDC上代表性配体[6]

三、已上市的PDC药物

最早获批的PDC药物是111In-DTPA-Octreotide（Octreoscan®），一种通过静脉注射定位癌性肿瘤的诊断药物，于1994年在美国推出。奥曲肽（Octreotide）被用作靶向生长抑制素（SST）受体的肿瘤靶向肽，111In作为Payload与DTPA（Diethylene triamino pentaacetic acid）螯合。尽管在转移性神经内分泌肿瘤患者中使用高剂量Octreoscan®可以缓解症状，但肿瘤大小的消退并不令人满意，因此仅被批准用于SSTR阳性肿瘤的诊断成像。

图4 已上市的PDC药物[6]

迄今为止最成功的放射性PDC治疗药物是177Lu-DOTATATE（Lutathera®），经肌注用于治疗SST受体阳性胃肠胰神经内分泌肿瘤。在晚期肿瘤患者中，与大剂量长效奥曲肽相比，177Lu-DOTATATE可致更长的无进展生存期和更高的应答率。

Melflufen（Pepaxto®）是Oncopeptides公司PDC平台的先导药物，这是一种首创的靶向氨肽酶（aminopeptidase）的PDC，能迅速将烷化剂Melphalan作为Payload传递到肿瘤细胞中。

图5 Melflufen（Pepaxto®）的作用机制示意图[7]

Melflufen具有高亲脂性，能被骨髓瘤细胞迅速吸收。一旦进入细胞内，Melflufen的偶联肽会立即被氨肽酶裂解，释放出亲水性烷化剂Melphalan，并被留在细胞内，同时引起Melflufen的进一步进入和裂解，直至细胞外的Melflufen全部被消耗完。之前FDA基于关键II期HORIZON研究的结果加速审批，于2021年2月26批准Pepaxto®联合地塞米松，用于治疗成人复发性或难治性多发性骨髓瘤。而于2021年10月该公司因III期OCEAN研究失败，已决定从美国市场撤回。

表1 Melflufen的各期研究[8]

目前仍有多种PDC药物的研究正处于不同的临床试验阶段。

表2 目前处于临床研究阶段的PDC药物[6]

国内目前已有多家企业开发PDC药物。盛诺基医药与加拿大公司Angiochem合作开发的SNG1005（又称ANG1005），正在开展III期临床试验。SNG1005是一种穿透血脑的多肽-药物偶联物，是目前国内外首个能将紫杉醇特异性递送至脑部的化药1类新药，显示治疗乳腺癌脑软膜转移癌和复发性乳腺癌脑实质转移癌的活性。

博瑞医药开发的长效多肽靶向偶联药物BGC0228是由疗效明确的拓扑酶Ⅰ抑制剂与具有肿瘤靶向的多肽结构偶联而成，能靶向肿瘤组织高度表达的CD44，使药物在肿瘤部位富集，高分子载体可延长药物的作用时间，临床拟开发用于小细胞肺癌，胰腺癌，结直肠癌，乳腺癌等多种实体瘤的治疗。

四、PDC药物的优势与局限

4.1 优势

在临床应用中，与非靶向抗癌药物相比，PDC在延长血液循环时间、增加最大耐受剂量、增强肿瘤积聚、提高抗癌生物活性方面显示出巨大优势。缺乏靶向受体的正常细胞不能与肿瘤靶向肽结合，因此PDC可通过分布、靶向识别肿瘤细胞并进行跨膜转运，在受体阳性肿瘤细胞中富集，显著增加肿瘤:非肿瘤比率，从而降低剂量，并减少效应分子对正常细胞的损伤，减少毒副作用。另外，PDC还可以依靠多肽的特性来克服小分子药物的局限性，并表现出更高的溶解性、渗透性和选择性，以及降低毒性。

同时，PDC与其它靶向抗癌药物如ADC相比较，尽管都是药物通过共价连接到靶向配体上，且在肿瘤治疗方面都具备较大的潜力，但二者仍存在一定的区别。近年来，研究界也逐渐认识到肽的优势。肽的大小远远小于单抗，一个单抗（IgG）至少1000个氨基酸（~150 kDa），而用于靶向癌细胞的肽长度通常为5~25个氨基酸。大多数单克隆抗体因其较大的分子量而无法有效地扩散到恶性肿瘤组织中，而多肽的低分子量使其对固体组织的渗透增强，从而产生更好的抗肿瘤效果。PDC相较于ADC也可以装载更多的药物。同时较小的分子量使PDC的肾脏清除率较高，可使PDC有效地排出体外，减少累积毒性。

目前获批的ADC大都采用异质化连接技术，即基于胺的赖氨酸结合（amine-based lysine conjugation）和基于巯基的半胱氨酸结合（thiol-based cysteine conjugation）。每个抗体具有多个Lys/Cys位点，所以将小分子药物与抗体结合得到的ADC是含有不同DAR值的多种成分的混合物。ADC通常含有药物与抗体比率介于3和8之间。这可能会导致批次之间的差异，导致全身给药后的药代动力学（PK）较为复杂[3]。而PDC由于体积小，可以很容易地合成为单一同质的物质，具有良好的特征，可用于精确的大规模生产，并可以得到较好的PK结果，成本也相对较低。而且PDC由于其短肽特性，在结构上更加灵活，设计更简单，合成过程中还可以直接引入非天然氨基酸进行修饰和形成环肽等，在直接合成的过程合理优化侧链和主链结构，从而增加结合亲合力[9]。如，肽序列可以根据所需的物理化学性质（如溶解度、稳定性和总电荷）或与偶联效应分子所需的特征基团来选择。

单抗往往具有免疫原性，而且它们倾向于聚集在肝脏和肾脏等排泄器官。而对于PDC而言，无论是多肽，连接子，还是小分子药物，其免疫原性都相对较低。

图6 不同靶向治疗方法示意图[7]

4.2 局限性

尽管有这些优点，但PDC作为治疗药物其应用仍存在局限性。

（1）多肽的口服生物利用度低，主要以注射形式给药，以防止胃肠道降解。尽管注射剂可以在体内快速分发，但其给药所需的专业操作限制了其应用。

（2）多肽能被蛋白质水解酶迅速裂解，并能被肝和肾从血液循环中迅速清除。多肽较短的生物半衰期导致PDC在体内分布的时间有限，在靶向肽降解之前，留给效应分子进入肿瘤细胞的时间相当有限。这可以通过不同的修饰和稳定方法来改善。目前延长肽生物半衰期的方法有很多，包括头尾环化（head-to-tail cyclization）、二硫键环化（disulfide bond cyclization）、取代非自然氨基酸、拟肽（peptidomimetics）、钉肽（stapled peptides）和自行车策略（bicycle strategy）[6]。

（3）PDC需要依赖于体内pH值、氧化还原和酶的生物活性来释放其Payload。有些Payload不能作为原型药物释放，有些根本不能释放。与原型药物相比，添加额外基团的Payload的生物活性显著降低。因此，有必要证明PDC的活性靶向优势可以抵消Payload不完全裂解导致的生物活性降低[10]。

（4）与较小的肽相比，抗体对靶蛋白/受体的特异性更高。PDC的靶向性可能不如ADC好。

五、药代动力学

肽的PK特性与小分子药物有很大的不同。肽类药物的一个重要局限性是其口服生物利用度低，因此只能通过非肠道途径给药。

大多数Linker在进入系统的那一刻就开始裂解，从血浆（血液）开始，然后是癌细胞的细胞外环境，然后剩下的PDC被癌细胞吸收用于药物的细胞内转运[2]。

5.1 吸收

PDC药物通过非肠道途径给药，经循环系统转运，然后通过毛细血管壁到达靶细胞。如177Lu-DOTATATE则通过静脉滴注30min给药。

对于CPP药物偶联物，跨膜转运被认为是一个不依赖能量的过程，一些研究表明CPP-drug偶联物可以直接穿过脂质双分子层，而也有报道称CPP-drug偶联物可以通过内吞或受体介导的不依赖能量的非内吞转运途径。

另一方面，对于CTP 药物偶联物，跨膜转运始于多肽与介导PDC内吞的膜受体的结合，在此过程中偶联物可能通过早期和晚期内吞体，最终进入溶酶体，最后受体被循环到细胞膜表面。

图7 PDC跨膜转运机制。三种类型的PDC跨膜转运和细胞内分裂机制示意图[5]。PDC的靶向肽/靶向小分子与膜受体结合并介导PDC的内吞作用(靶向肽也可能引起下游细胞通路的改变)，细胞穿透肽可以直接通过脂质双分子层转运进入细胞。随着酶浓度的逐渐升高和酸度的逐渐降低，PDC转移到细胞中，然后肽和小分子药物被释放至细胞质、细胞核或其他细胞器。

5.2 分布

PDC通过靶向肿瘤的多肽分子转运到肿瘤细胞的膜受体，然后通过内吞和内化等跨膜效应从细胞外转移到细胞内。有文献[11]报道与游离阿霉素相比，肽-阿霉素偶联物在肿瘤中的分布增加了3 ~ 5倍，在正常器官中的分布浓度降低，血浆半衰期更长，体内清除率较慢。

177Lu-DOTATATE在给药4小时后分布于肾脏、肿瘤病灶、肝脏和脾脏。在一些病人的垂体和甲状腺也有分布。在给予单一治疗剂量177Lu-DOTATATE后，平均分布体积为460 L（CV为54%）[12]。

Melflufen是一个烷基化药物，具有亲脂性，能快速地从血浆中清除，并分布到周围组织中，后期也不会再分布到血浆中。在给予单一治疗剂量Melflufen后，Melflufenr 平均分布体积为35L（CV为71%）, Melphalan平均分布体积为76L（CV为32%）[13]。

5.3 代谢

177Lu-DOTATATE不进行肝脏代谢。根据放射性高效液相色谱分析（radiometric HPLC），177Lu-DOTATATE大部分经尿液回收（平均99.8%，范围92.4 1至100%）[12]。

Melflufen在组织内代谢成desethyl-melphalan flufenamide和melphalan，melphalan主要通过自发水解代谢为一羟基melphalan和二羟基melphalan[13]。

5.4 排泄

肾脏清除率较高可使PDC有效地排出体外，减少累积毒性。但肽的快速清除也限制其治疗应用。177Lu-DOTATATE的平均清除率（CL）为4.5 L/h (CV为31%)，平均有效血液消除半衰期为3.5±1.4小时，平均终末血液半衰期为71±28小时。177Lu-DOTATATE主要经肾脏清除，5小时内累积排泄44%，24小时内累积排泄58%，48小时内累积排泄65%[12]。

40 mg的Melflufen在滴注结束后，Melflufen平均清除率（CL）为692 L/h(CV为49%)，平均消除半衰期为2.1分钟（CV%为34%）。Melphalan平均清除率（CL）为23 L/h(CV为23%)，平均消除半衰期为70分钟（CV%为21%）[13]。

六、生物分析

6.1 PK研究

（1）放射性组分检测方法

对于Payload为放射性核素的PDC药物可以采用放射性高效液相色谱或其它技术通过检测放射性组分而确定其血浆浓度。177Lu-DOTATATE在血浆和尿液中的浓度采用总放射性自动计数法（如Nal spectrometer）测定，并使用标准物质177Lu作标准曲线。校正因子是标准物质（kBq）与五种计数率（cps或cpm）测量值平均值之间的比率。每次总活性是由每个样本的活性，乘以根据患者性别、体重和身高而确定的总血量得出的。时间-活性的百分率曲线由注射的活性归一化后得到[12]。

（2）HPLC-MS /MS

对于Melflufen（Pepaxto®）使用HPLC-MS/MS测定给药前到给药后360 min血浆中Melflufen和经裂解后释放的Melphalan的浓度[13]。静脉滴注Melflufen 30 min，剂量为50 mg，标准曲线范围均为20~2000 ng/mL。由于Melflufen的稳定性有限，样品在采集后立即进行低温离心，并用干冰运输，并在低温条件下处理。Melflufen在滴注结束后即达到Cmax，而Melphalan大约在滴注结束后的5~15 min达到Cmax。随着Melflufen的滴注，Melphalan的释放非常迅速。另外体重和性别对Melphalan的清除无明显影响[8]。

表3 Melflufen和Melphalan的药代动力学（50 mg Melflufen）[8]

图8 Melflufen和Melphalan的浓度-时间曲线[8]

阳光德美开发了具有高灵敏度、高特异性的高效液相色谱-质谱/质谱（HPLC-MS/MS）定量分析方法，测定人血浆中PDC原型药物、细胞毒性药物及其代谢产物的浓度以及肽的浓度。对于分子量较大的PDC药物，建议对其免疫原性进行分析。

（3）ELISA

NGR-hTNF是由人TNF-a与肿瘤归巢肽天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸（NGR）融合而成的PDC药物。NGR能够选择性地与肿瘤血管上高表达的氨基肽酶N亚型结合。

NGR-hTNF可通过ELISA方法检测[14]。在前3个周期的第1天进行PK血液采样，在基线（NGR-hTNF给药前）和30、60、90（顺铂给药前）、135、179（顺铂输注结束前）、210、240、200、300和360分钟采集样本。对于NGR-hTNF和顺铂，血药浓度-时间曲线如下图，使用标准的非室间法，从血浆浓度-时间数据估计表观末端消除半衰期（t1/2）。

图9 NGR-hTNF前三个周期的药代动力学结果[14]

6.2 免疫原性

尽管PDC各组分的免疫原性都比较低，但组合成PDC分子后，PDC的分子量，尺寸和复杂性都会大幅增加，这些将增大免疫原性发生的可能性。FDA要求企业在提交多肽类药物IND申请时，应评估其免疫原性。PDC具有比多肽更大的分子量和尺寸，更高的复杂性，因而也应该进行免疫原性研究。免疫原性的研究要求和方法可同等参考蛋白免疫原性的相关指导原则。

七、结语

近年来，随着蛋白质组学、噬菌体展示技术、固相多肽合成等技术的快速发展，越来越多的新多肽被发现或合理设计，极大地促进了PDC的发展。但Pepaxto®的III期研究失败及撤回决定也显示该技术还不够完善。相信在不远的未来，随着研究的深入，会有越来越多优秀的PDC药物出现，为患者提供更多更好的治疗选择。全面了解PDC药物的药代动力学、生物分析，对于设计更高效、靶向性更好的PDC药物和更好地控制不良反应具有重要意义。

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